01、什么是qPCR

定量聚合酶鏈式反應（qPCR），作為分子生物學領域的一項革命性技術，憑借其高精確度和準確性，已對生物醫(yī)學研究產(chǎn)生了深遠的影響。

作為經(jīng)典PCR技術的的高級形式，qPCR，也被稱為實時熒光定量PCR，利用了新合成DNA鏈中特定染料的熒光信號增強，或是針對特定DNA序列的探針釋放的熒光片段，來監(jiān)測DNA的互補過程。這一技術的核心優(yōu)勢在于，它能將DNA的檢測與擴增過程相結合，即時為科研人員提供重要的數(shù)據(jù)信息。

qPCR和傳統(tǒng)PCR的基本操作原理相似，即通過DNA聚合酶催化DNA的補充，將新的標記序列添加到短的單鏈DNA片段上，即引物的3'-OH斷裂。以這一系列反應在配備有熒光檢測系統(tǒng)的專用熱循環(huán)儀中進行。通過測量熒光信號強度，將其與預設的閾值或標準曲線相比較，從而實現(xiàn)DNA含量相對或絕對定量分析。

02、qPCR應用領域

qPCR憑借其實時監(jiān)測、高靈敏度與特異性，能夠?qū)崿F(xiàn)對遺傳物質(zhì)極為精準的測量，并在多個領域中具有不可估量的應用價值。

1. 基因表達譜分析：qPCR技術能夠定量特定基因在不同條件下的表達水平，為揭示基因功能、調(diào)控機制及疾病發(fā)生發(fā)展過程中的基因表達變化提供依據(jù)。

2. 病原體檢測：qPCR能夠快速、準確地檢測出微量的病原體DNA或RNA，為疾病的早期診斷、疫情監(jiān)控及治療效果評估提供支持。

3. 遺傳變異研究：利用qPCR技術，科研人員能夠檢測并分析遺傳序列中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入/缺失變異等遺傳變異，為遺傳病篩查、個性化醫(yī)療及藥物研發(fā)等領域的研究提供信息。

4. 環(huán)境監(jiān)測：qPCR能夠高效檢測水體、土壤及空氣中微生物群落的變化，評估環(huán)境質(zhì)量，監(jiān)測污染源的生態(tài)影響，為環(huán)境保護和治理提供依據(jù)。

5. 臨床診斷：qPCR已成為多種疾病診斷、預后評估及治療效果監(jiān)測的重要手段。通過檢測患者體內(nèi)特定基因或病原體的表達水平，醫(yī)生能夠制定更加精準的治療方案。

03、qPCR 的工作原理

qPCR反應的核心開始于一個混合體系，該體系包含了DNA聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸酯（dNTPs，作為DNA合成的原料）、特定設計的引物（用于識別并啟動DNA鏈的延伸）、熒光染料或報告探針（用于實時監(jiān)測DNA擴增過程），以及待檢測的模板DNA。

04、qPCR 的關鍵步驟

變性階段：在高溫條件下（常規(guī)設定為94°C至98°C之間），雙鏈DNA解開成單鏈DNA。

退火階段：在溫度稍低的環(huán)境中（大約50°C至70°C之間），使設計的引物與模板DNA中的目標區(qū)域相結合，形成引物-模板DNA復合物。

延伸階段：在DNA聚合酶的催化作用下，溫度調(diào)至酶活性的范圍（通常在68°C至72°C之間），酶沿著引物結合的起點，以模板DNA為模板，逐個添加核苷酸，產(chǎn)生兩條互補的 DNA 鏈，形成雙鏈DNA。

定量完成階段：在每一輪DNA補充時，通過熒光計測量并記錄這些熒光信號，以做定量分析。

05、qPCR 檢測方法

常見的qPCR檢測方法包括DNA插層染料、水解探針、分子信標和LNA探針。

06、qPCR的引物設計注意事項

引物的設計長度推薦在15至30個堿基對之間，這樣有助于70至200個堿基對的目標序列進行高效互補。

為確保PCR反應的順利進行，所選用的正向和反向引物應具有相近的熔解溫度（Tm），理想范圍設定在60°C至65°C之間。

引物的3'端應充足GC，可以提升引物與模板DNA結合的效率和提高熔解溫度。引物的GC含量應控制在40%至60%之間，以達到最佳的擴增梯度、穩(wěn)定性和擴增效率。

退火溫度通常建議比引物的Tm值低約5°C，這樣做是為了減少非極化的可能性。

07、qPCR常見問題及解決方法

問題1.qPCR 擴增效率低

問題原因：

試劑與反應體系因素：如試劑降解、過期或保存不當導致的活性降低。或者加液量不足或成分比例不當而導致效率低。

引物與標記設計問題：引物和熒光標記（或探針）的設計存在缺陷。包括引物與模板DNA的結合力不夠強、引物間形成二聚體、產(chǎn)物長度過長以及未能充分優(yōu)化反應條件。

解決方法：

保證所有qPCR試劑質(zhì)量良好，嚴格按照說明書儲存和使用。確保加液量準確無誤，以減少操作誤差。

利用文獻資源或?qū)I(yè)設計軟件重新設計引物和標記。以確保產(chǎn)物長度控制在80到150堿基對之間，同時，根據(jù)引物的特性調(diào)整和優(yōu)化PCR反應條件。

  問題2：結果出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象

問題原因：

試劑與反應體系因素：可能試劑或模板受到污染，此外，反應體系中鎂離子濃度過高或引物濃度過高等原因?qū)е?/span>，也可能產(chǎn)生假陽性。

設計問題：引物設計存在缺陷，不恰當?shù)囊镄蛄锌赡軐е乱镩g形成二聚體或發(fā)夾結構，影響PCR后續(xù)的反應的進行，最終表現(xiàn)為假陽性結果。

解決方法：

嚴格遵守實驗室操作規(guī)程，人群小心操作試劑或模板的污染。

一旦發(fā)現(xiàn)污染情況，應立即排查并處理，必要時更換受污染的試劑或者模板。

在引物設計完成后，用專業(yè)的軟件進行驗證，確保避免引物之間的二聚體和發(fā)夾結構的形成。

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