簡介

        土壤宏基因組學技術是近來發展比較迅速的一種新方法，是研究土壤微生物生態學的基礎，也是獲是土壤中各種基因資源的一種有效手段。宏基因組學又叫環境基因組學（Environmental Genomics）或群體基因組學（Community Genomics），定義為利用現代基因組技術直接研究自然狀態環境中的有機體群落，而不需要分離、培養單一種類的微生物。研究環境基因學的前提就是要獲得質量足夠好的DNA，由于土壤微生物往往會與土壤其他組分緊密結合，這就增加了提取土壤DNA的難度。常用的方法包括直接提取法和間接提取法。直接提取法是將樣品直接懸浮在裂解緩沖液中處理，使其釋放DNA，繼而抽提純化；間接提取法是首先去除土壤等雜質，通過不同的離心速度從土壤中分離出細胞，然后對細胞進行抽提。直接提取法提取的DN**段較小（1~50kb），提取率高，操作簡單；間接提取法提取的片斷較大（20~500kb），純度高，但操作繁瑣，有些微生物在分離過程中會丟失得到的DNA并非土壤樣品中的全基因組(宏基因組)，目前已經很少研究者會采用這種方法。
        直接法純化土壤DNA最大的難點是如果有效除去與核酸分子非常相似的腐殖酸，因為痕量的腐殖酸的存在對后續的實驗影響嚴重，比如PCR失敗等。傳統的純化方法幾乎不能有效除去腐殖酸，GBCBIO Technologies公司經過技術公關，在如何有效除去腐殖酸等抑制因子上取得重大突破，研發出高效的腐殖酸吸附劑，能夠徹底除去腐殖酸等抑制因子，腐殖酸吸附劑是添加在裂解的過程中，后續的純化采用硅膠柱的方式，因而操作上更簡單，無繁瑣的操作。GBCBIO公司的土壤DNA提取試劑盒能與進口MOBIO公司的相媲美。

實驗流程：

1. 稱0.3-0.5g土壤置于2ml離心管中，加入0.4g Glass Beads，再加入780μl Buffer C1與100μl Buffer C2。渦旋器高速震蕩3-5min。

注意：Buffer C2是我司獨特的腐殖酸除去劑，100μl對大部分樣品來說足以有效除去腐殖酸等抑制因子。對一些腐殖酸含量特別豐富的土壤， Buffer C2的量可以適當增加，但不能超過250μl，否則會嚴重影響DNA的得率。

2. 加入100μl Buffer C3（C3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），渦旋混勻。70℃水浴處理10min。期間振蕩幾次。

注意：如果要純化革蘭氏陽性菌的DNA，請在70℃處理完后，再90℃水浴處理2min。

3. 12000 rpm(~13000×g)離心1鐘，轉650μl上清到1.5ml離心管中，加入150μl BufferC4混勻。

4. 冰上放置5min。12000 rpm(~13000×g)離心1鐘。

5. 轉移上清到新的2ml離心管中，加入0.7倍的異丙醇，顛倒混勻，12000 rpm(~13000×g)離心2鐘。

注意：如果是DNA含量很低的土壤樣品，建議離心前-20℃放置1小時。

6.倒掉上清，倒置離心管于吸水紙上30-60秒。加入100μl滅菌去離子水，再加入350μl Buffer C5（必須把Buffer C5混勻后再吸取），渦旋混勻，70℃水浴放置數分鐘，至沉淀完全溶解即可。

7. 12000 rpm(~13000×g)離心1鐘，400μl轉移上清到新的1.5ml離心管中，加入150μl無水乙醇，混勻。

8. 將上一步所得溶液加入到GBC吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心30秒，倒掉濾過液重新套回收集管。

9. 向GBC吸附柱中加入500 μl Buffer WB，12,000 rpm (~13,000×g ) 離心30 秒，倒掉廢液，將GBC吸附柱放入收集管中。

10. 向GBC吸附柱 中加入650 μl DNA Wash Buffer（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm (~13,000×g ) 離心30 秒，倒掉廢液，GBC吸附柱放入收集管中。

11. 向GBC吸附柱 中加入650 μl DNA Wash Buffer，12,000 rpm (~13,000×g ) 離心30秒，倒掉廢液，將GBC吸附柱放入收集管中。

12. 12,000 rpm(~13,000×g)離心2 分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

13. 將GBC吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30-100 μl 洗脫緩沖液TE或滅菌去離子水，室溫放置2-5 分鐘，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心2 分鐘，將溶液收集到離心管中。

注意：為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2 分鐘，12,000 rpm(~13,400×g )離心2 分鐘。洗脫緩沖液體積不應少于30 μl，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其pH 值在7.0-8.5 范圍內(可以用NaOH將水的pH值調到此范圍)，pH 值低于7.0 會降低洗脫效率；且DNA 產物應保存在-20℃，以防DNA 降解。

實驗結果

腐殖酸吸附劑（Buffer C2）使用效果比較
在土壤樣品裂解時，比較加與不加Buffer C2的所獲得的裂解液澄清度。從上圖看，加有Buffer C2的樣品，顏色明顯淺很多，說明Buffer C2對出去腐殖酸、色素等效果明顯。
1,2：裂解時加入Buffer C2
3,4： 裂解時未加Buffer C2

裂解液加Buffer C4進一步沉淀除雜效果：
上一步獲得的裂解液上清加入Buffer C4進一步處理，沉淀離心除雜，裂解時加有Buffer C2(腐殖酸吸附劑）的，再經Buffer C4處理幾乎不再有顏色，而不加Buffer C2的顏色還很深。
1,2：裂解時加有Buffer C2
3,4：裂解時不加Buffer C2
 

 
1, 2: SDS高鹽酚氯仿抽提法
3, 4: 使用Soil DNA Kit提取
1, 3: 為花基土壤
2, 4: 河邊淤泥
  
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