慢病毒概述

慢病毒( Lentivirus)屬于逆轉錄病毒科(Retroviridae)，為RNA病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒等。由于對HIV-1的研究最廣泛最深入，對其生物學特性最為了解，因此HIV-1來源的慢病毒載體已成為其中的代表。

圖1 HIV-1 RNA結構圖

HIV-1為雙鏈RNA病毒，共有9個基因，如圖1所示。gag、pol、env3個基因編碼病毒的基本結構，tat、rev為調節基因，vif、vpr、vpu、nef 4個為輔助基因。其中，gag基因編碼病毒的核心蛋白，包括基質蛋白、衣殼蛋白、核衣殼蛋白；pol基因編碼病毒復制所需的酶，如反轉錄酶、整合酶、蛋白酶，env基因編碼病毒的包膜糖蛋白，決定病毒感染宿主的靶向性。rev編碼的蛋白調節gag、pol、env的表達水平，tat編碼的蛋白參與RNA轉錄的控制。4個輔助基因編碼的蛋白則作為毒力因子參與宿主細胞的識別和感染。兩端為長末端重復序列（LTR），內含復制所需的順式作用元件，如包裝信號元件Ψ。

第一代慢病毒載體系統是以三質粒系統為代表，該系統由包裝質粒、包膜質粒及載體質粒3種質粒組成。包裝質粒是HIV-1前病毒基因組5’端LTR由巨細胞病毒早期啟動子取代，3’LTR由SV40 polyA序列取代。包裝成分分別構建在兩個質粒上，一個表達gag和pol，另一個表達env。載體質粒攜帶了5’端LTR，和全部5’端非翻譯區域，另外還帶有rev應答元（RRE）。包膜表達質粒使用水皰性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用來代替了原病毒的env基因。

第二代慢病毒載體系統是在第一代的基礎上進行改進，在包裝質粒中刪除了HIV的所有輔助基因（vif、vpr、vpu和nef基因）。這些附屬基因的去除并不影響病毒的滴度和感染能力，同時增加了載體的安全性。

第三代慢病毒載體系統由四質粒代替原有的三質粒包裝系統。將rev基因單獨放在一個包裝質粒上。同時又增加了兩個安全特性：一是構建自身失活的慢病毒載體，即刪除了U3區的3′LTR，使載體失去HIV-1增強子及啟動子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉錄出RNA；二是去除了tat基因，用異源啟動子序列代替，這樣原始的HIV-1基因組中的9個慢病毒載體中只保留了3個(gag、pol和rev)。因此第三代慢病毒載體系統更加安全。

慢病毒優點

1、宿主范圍廣包裝病毒時用VSV-G基因代替了原病毒的env基因，宿主范圍更廣，如神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞。 

2、感染能力強慢病毒載體對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，能感染絕大多數細胞，對一些難于轉染的細胞，比如神經元細胞、干細胞或其它原代細胞有較好的感染效率。    

3、具有整合能力  慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達，因此可用于構建穩定表達目的蛋白/RNAi的細胞株，也可以用于制備轉基因動物。

整體實驗流程

慢病毒包裝技術路線：

包裝過程：

（1)轉染前一天，將細胞接種到100mm dish中，控制細胞轉染時的密度為70-80%。

（2)轉染前一小時取出細胞培養板，去除原有細胞培養基，加入10ml的Opti-MEM培養基，將細胞放回培養箱。

（3)制備轉染試劑和質粒的復合物： 

將待轉染的病毒載體質粒32μg（骨架質粒：穿梭質粒=1:1）溶于Opti-MEM培養基，總體積為500μl，輕輕混勻，靜置5min。 

將Lipofectmin2000轉染試劑溶于Opti-MEM培養基，總體積為500μl，輕輕混勻，靜置5min。 

將Lipofectmin2000轉染試劑稀釋液滴加到質粒稀釋液中，邊加邊輕輕混勻后在室溫放置20min，使DNALipofectmin2000轉染試劑充分結合形成穩定的轉染復合體。

取出細胞培養板，將上面配好的DNA- Lipofectmin2000轉染試劑復合體加入到細胞培養板中，做好標記，放回培養箱。
6h后吸去培養基，PBS洗一次，加入10ml新鮮完全培養基培養。

收毒：

（1)轉染48h后，第一次收毒，收集培養基至50ml離心管中，做上標記，并給細胞更換新鮮的完全培養基。

（2)轉染72h后，第二次收毒，收集培養基至50ml離心管中，做上標記，丟棄細胞。

注：廢棄的含病毒的培養基加入84消毒液（1:20左右），浸泡一天后丟棄。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養板等其他物品可用84消毒液稀釋液處理，也可以用煮沸處理半小時或高壓濕熱滅菌（121℃，30min）處理。

3.慢病毒純化：

（1)普通離心機：3500rpm，10min，RT離心后，上清馬上倒入新的50ml離心管，0.45μm，過濾上清到超速離心管中。上清分裝到12支超速離心管，兩兩對應配平衡，不夠的體積可用不含血清的培養基配平。

（2)超速離心機：HITACHI，30,000rpm，2h，4℃，離心后，可觀察到管壁一側有白色的病毒沉淀，做上記號。在安全柜中，打開離心管，小心地棄上清，離心管倒扣在滅菌過的吸水紙上，棄未去除干凈的上清。每管根據沉淀量添加DPBS，80μl-120μl/管，用封口膜封住管口，4℃溶解沉淀過夜。

（3)將同一種病毒，逐管收集法收集病毒到最后一管，再用100μl DPBS收集2次，全部收到1.5ml 離心管中，按要求分裝病毒，標記（病毒名稱，年-月-日）-80℃冰箱保存。

（4.）慢病毒滴度檢測（Real time 定量PCR 法測定滴度）：

（1)樣品制備：

（a)消化293T細胞，按1×105細胞每孔接種24孔板。

（b)細胞貼壁后（鋪板后4~6h）加入病毒。

（c)12~20h后換液，去掉含病毒的培養基。

（d)感染后72h拍照記錄熒光，收集細胞抽取基因組DNA并做定量PCR實驗測定滴度。

（2)Real-time PCR 檢測：

Real-time PCR 在ABI7500 上完成。SYBR Master Mixture 來自TAKARA。

(a)下列比例配置反應體系：

(b) 設定程序為兩步法Real-Time 定量。預變性95℃，15s，之后每一步變性95℃，5s，退火延伸60℃，34s，共進行40 個循環。每次在延伸階段讀取吸光值。
Cycle 1: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:15.
Cycle 2: (40X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:05.
Step 2: 60.0 ℃ for 00:34.
Data collection and real-time analysis enabled.

(c) 制作熔解曲線。PCR 結束后， 在95℃變性1min。然后冷卻至55℃，使DNA 雙鏈充分結合。從55℃開始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s， 同時讀取吸光值。
Cycle 3: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 01:00.
Cycle 4: (1X)
Step 1: 55.0 ℃ for 01:00.
Cycle 5: (81X)
Step 1: 55.0 ℃-95.0 ℃ for 00:30.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃           

                                  
服務流程：

北京畢特博生物提供的慢病毒：

我們采用第三代4質粒慢病毒包裝系統，生物安全性更高； 

采用VSV-G包膜，宿主范圍更廣； 

產生的慢病毒滴度高，可達108~1010TU/mL； 

各種慢病毒穿梭載體可供選擇：過表達、ShRNA、miRNA、Tet誘導表達載體等； 

可帶有熒光報告基因（GFP、RFP、mCherry、Luciferase等）和藥篩標記基因（Puromycin、Neomycin、Hygromycin等），有多種啟動子（CMV、PGK、CAG、Ubc等）可供選擇； 

3~4周內即可完成病毒包裝服務。

運輸和儲存 

對于長距離運輸，應先將慢病毒載體保存在-80℃，再采用全程干冰運輸，以防滴度下降。 

慢病毒載體在-80℃保存6個月，滴度不會明顯下降。建議保存6~12個月以上的樣品，進行實驗前，重新測一次滴度。應盡量避免反復凍融（小于3次）。 

使用前從-80℃取出病毒，立即放在37℃水浴鍋中，輕輕晃動，使其盡快溶解，操作過程應置于冰盒上進行。用不完的

毒可以暫時放在4℃冰箱中，但最好盡快用完。

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